新型表观分子标志5—hmC的研究进展

新型表观分子标志5—hmC的研究进展

5-hmC是甲基化胞嘧啶的羟化形式，在哺乳动物中由TET家族介导5-mC的氧化酶促反应生成，是一种在基因去甲基化及表达调节方面起特定作用的表观分子标志。5-hmC在调节胚胎干细胞分化及组织发育、正常造血等发面发挥生物学作用；5-hmC异常与基因组异常甲基化、基因表达调节障碍及细胞恶变有关。自从2009年以来，为深入研究这一表观分子，β-葡萄糖基转移酶修饰、抗体、化学修饰、第三代测序等5-hmC检测方法陆续出现。5-hmC相关表观遗传学作用研究将有助于正常组织发育及疾病发生发展机制的理解、疾病早期诊断及有效治疗靶标的寻找。

标签：5-hmC；去甲基化；表观遗传学；TET2

5-羟甲基化胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine， 5-hmC） 是5-甲基化胞嘧啶（5-methylcytosine， 5-mC） 的羟化形式，在哺乳动物中可以由TET家族蛋白介导的5-mC的氧化酶促反应生成，继5-mC之后，5-hmC被称为人类的第六种碱基。因为胞嘧啶的羟甲基化可能决定了某一基因的开关，所以5-hmC在表观学方面具有重要作用。本文就5-hmC的发现、功能、作用机制及检测方法做一综述。

1. 5-hmC的发现及历史

5-hmC表观标志最早是在1952年T-偶数系噬菌体中发现的[1]。1972年Penn等[2]通过将5-hmC转化为5-羟甲基尿嘧啶后进行色谱分析在大鼠脑及肝脏组织中发现5-hmC，5-hmC占全部胞嘧啶的15%左右，并在小鼠及青蛙脑组织中发现5-hmC。直到2009年以后，多个研究小组发现5-hmC也是哺乳动物DNA的正常组成部分[3，4]。

2. 5-hmC的作用及功能

2.1 5-hmC在细胞分化及组织发育中的作用

胚胎干细胞具有自我更新和多向分化的潜能。最近发现5-hmC与胚胎干细胞的分化及个体的早期发育有关，5-hmC的减少可导致胚胎干细胞多能性的丧失[5]。尽管5-hmC在小鼠胚胎干细胞中含量丰富，但在胚胎干细胞分化后5-hmC含量逐渐减少[6]，机制不明。

因5-hmC在中枢神经系统中含量丰富，提示其在中枢神经系统发育中可能有特定作用。Orr等[7]运用免疫组化方法检测5-hmC在人脑组织不同发育阶段的含量发现：在脑组织发育过程中，5-hmC在胎儿皮质等较分化部分含量高，而在脑室周围的祖细胞区域含量低。

2.2 5-hmC与肿瘤

目前，5-hmC与肿瘤的关系受到广泛关注，5-hmC在肿瘤组织中的含量及肿瘤发展过程中的变化研究逐渐增多。5-hmC是否可用于区别正常及恶变组织呢？

5-hmC在肿瘤生物学行为中作用如何？Orr等[7]发现5-hmC在恶性胶质瘤中含量下降，低5-hmC水平与恶性胶质瘤的短生存期相关。Yang等[8]运用免疫组化及斑点杂交方法发现，在人类乳腺癌、肝癌、肺癌、胰腺癌及前列腺癌组织中较对应的周围正常组织5-hmC含量明显降低。Lian等[9]报道5-hmC的丧失是黑色素瘤的表观标志，对其诊断及预后有重要作用。

以上研究结果显示5-hmC在人类多种肿瘤组织中较正常组织含量降低，并与患者生存期相关，提示5-hmC可能作为区别肿瘤组织与正常组织、指导肿瘤诊断及评估肿瘤预后的重要表观分子标志，甚至为肿瘤的治疗提供表观线索。

2.3 5-hmC与造血系统发育及疾病

TET2和5-hmC与造血系统正常发育有关，TET2表达或5-hmC水平异常干扰细胞内稳态，最终导致造血细胞增殖及成熟的异常。

在人类造血干/组细胞及成熟血细胞中均可检测到5-hmC，Pronier等[10]研究发现：TET2基因敲除的脐血CD34+细胞表现出向粒-单核系分化的增加，而向淋系及红系分化的减少；在人类脐血CD34+细胞中RNA干扰抑制TET2表达可降低5-hmC水平，提示TET2基因异常影响5-hmC水平，并通过干扰髓系分化参与髓系肿瘤的发生。在MDS、MPN及AML等多种造血系统肿瘤细胞中均可见TET2突变导致其催化活性丧失，5-hmC水平的降低[11]。

3. 5-hmC的作用机制

3.1 5-hmC与DNA去甲基化

研究发现5-hmC及TET家族蛋白通过多种途径及机制调节DNA去甲基化：①5-hmC的脱氨基产物5-羟甲基尿嘧啶（5-hydroxymethyluracil， 5-hmU） 可通过激活碱基切除修复途径介导去甲基化[12]；②TET蛋白不但可氧化5-mC为5-hmC，也可将5-hmC氧化为5fC及5caC，5fC和5caC在体及体外均可被胸苷嘧啶DNA糖基化酶识别并清除[13]。以上途径中，5-hmC在 DNA去甲基化中作为中间物质，TET家族蛋白作为DNA去甲基化的限速调节者。

TET蛋白酶可将5-mC转变为5-hmC，但人体内可以将5-hmC直接催化转变为胞嘧啶的去DNA羟甲基化酶是否存在，目前还不清楚。但体外实验证明哺乳动物DNA甲基化转移酶DNMT3A和 DNMT3B也是去DNA羟甲基化酶，有DNA甲基化转移酶及去羟甲基酶双重作用[14]。

3.2 5-hmC与基因表达调节

5-hmC及TET家族蛋白调节基因表达的机制目前尚不明确。蛋白质编码序列在哺乳动物基因组中只占很少部分，在基因与调控序列之外，仍然有许多功能未知的区域。5-hmC对基因转录及表达的影响目前尚存在矛盾结果。Ficz等[15]检测小鼠胚胎干细胞5-hmC分布发现：5-hmC在基因启动子区及CpG岛富集并与增强转录有关。Wu等[16]使用微阵列分析5-hmC在小鼠胚胎干细胞基因组中分布发现：5-hmC在转录激活基因的基因编码区、在转录抑制基因的启动子区富集，提示5-hmC在调节基因表达方面具有双重作用。Khare等[17]发现：5-hmC存在于外显子-内含子联接交界区，提示5-hmC在脑组织中参与RNA的剪接。以上结果显示5-hmC存在于基因组的基因及调节区均存在。5-hmC对转录的双重作用与所调节的基因有关。此外，5-hmC在RNA剪接中发挥一定作用。目前多数研究以小鼠为研究对象，5-hmC在人类基因表达调控中的作用尚需进一步研究。目前，TET2、5-hmC及其相互作用基因和蛋白网络研究尚需深入探索。但多项研究显示5-hmC不只是DNA去甲基化的一个中间产物，更是一个直接影响基因组结构及功能的稳定表观标志。

4. 5-hmC的检测方法

5-hmC潜在功能的研究需要准确的检测方法。2009年最早报道运用32P放射标记的薄层层析法发现了5-hmC[3]，并用于脑及胚胎干细胞中5-hmC的检测。但薄层层析及质谱分析方法较复杂，5-hmC在基因组中只占所有碱基的约1%，需要灵敏的检测手段，但其与5-mC一样不能被亚硫酸氢盐修饰为尿嘧啶，所以常规甲基化检测方法不能用于5-mC和5-hmC的区分[18]。随后基于抗原抗体、酶促及化学反应的富集方法出现，为准确的基因组单碱基测序打下基础。

4.1 β-葡萄糖基转移酶修饰

T4 β-葡萄糖基转移酶（β-glucosyltransferase，β-GT） 为最先选择的酶[19]。β-GT将5-hmC糖基化，而C及5-mC则不受影响。通过在5-hmC上添加经过修饰的葡萄糖，完成5-hmC的检测。β-GT修饰法大大提高了检测灵敏度，使得含5-hmC很低的细胞也可被检测，尤其是肿瘤细胞。随后Pastor等[20]通过GLIB（糖基化、高碘酸盐氧化和生物素化）法结合酶促和化学修饰把生物素与5-hmC连接，并利用链霉亲和素磁珠来富集生物素标记的含5-hmC的基因组DNA，洗脱后测序，此方法可分离出包含单个5-hmC的DNA片段。

4.2 抗体

2011年，抗5-hmC抗体广泛应用于5-hmC的检测[21]。羟甲基化DNA免疫沉淀便是通过5-hmC特异性抗体沉淀DNA，富集5-hmC。但因其密度依赖性地识别5-hmC，所以并不十分量化[22]。随后科学家通过亚硫酸氢钠处理基因组DNA，将5-hmC转换成5-亚甲基磺酸胞嘧啶（5-methylenesulfonate， CMS），利用CMS特异性抗体将包含CMS的DNA免疫沉淀下来[18]。虽然此方法较5-hmC抗体量化更准确，但这些抗体方法并不能克服其密度依赖性的检测局限。

4.3 化学修饰

亚硫酸氢盐测序是发现基因组中5-mC的标准方法，但它无法区分5-mC和5-hmC。因此，化学家[23]将双链DNA暴露在高钌酸钾（KRuO4） 中，通过氧化反应在5-hmC上添加一个氧原子，使其转变为5fC，在进入亚硫酸氢盐的测序步骤时，5fC将转化成尿嘧啶。随后采用此方法该研究小组检测了小鼠胚胎干细胞基因组DNA中的5-hmC分布。

4.4 第三代测序

测序是研究5-hmC潜在功能所必需的。聚合酶在修饰碱基周围的速率要比未修饰碱基周围速度慢，第三代测序技术可直接对5-hmC进行单分子测序。Pastor等[22]开发的单分子实时DNA测序是一种第三代的测序技术，可直接对5-hmC进行单分子测序。它利用单个DNA聚合酶分子进行DNA合成，并监控核苷酸的不断掺入，而不需要扩增。

5. 结语及展望

5-hmC在正常发育及疾病中的作用在过去的三年里受到广泛关注，多数研究在小鼠、大鼠及人类机体开展，将研究扩展到其他生物（比如斑马鱼等）将有助于5-hmC的进化保守功能研究的深入。尽管目前来自实体瘤及造血系统肿瘤的研究发现5-hmC是阻止肿瘤发生及进展的表观修饰因子，但并不清楚5-hmC含量的降低是肿瘤发生发展的原因还是结果。5-hmC及TET家族在正常细胞发育及肿瘤生物学中的作用及机制仍需进一步研究。

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